Certificación Miel de TEVO – MoniMony

Certificación Miel de TEVO – MoniMony

CERTIFICACIÓN DE ANÁLISIS DE MIEL
SRA. LUZMIRA MÓNICA RODRÍGUEZ
Apiario ubicado en Pichidegua, VI Región
Gloria Montenegro
Profesor Titular y Coordinador del Proyecto / Laboratorio de Botánica y de Productos Naturales / Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal
MARZO 2013

Miel_de_TeboApicultor: Luzmira Mónica Rodríguez
Código Ingreso: FIC6MPI016
Producto: Miel
Cantidad: 0,5 kg
Fecha Cosecha: Octubre 2012
Comuna: Pichidegua
Localidad: San Luis
Coordenadas UTM: 19 H, E 279677, N 6193190

Análisis realizados
I. Origen Botánico Método: De acuerdo a la Norma Chilena Oficial NCh2981.Of2005 “Denominación de origen botánico mediante ensayo melisopalinológico”

 

Grafico_Tebo_1

Interpretación:
La miel analizada corresponde a una muestra de miel Monofloral Endémica de Tevo (Retanilla trinervia) especie que aparece con 63% en relación a otras especies presentes. El Tevo es una especie endémica de Chile, decidua de verano, dominante del matorral de la Zona Central de Chile, cuya floración ocurre a fines de invierno y comienzos de primavera.

 

II. Determinación de Actividad Antimicrobiana
Método:
1.- Difusión en agar. Preparación de extractos acuosos de miel.
A partir de la muestra de miel recibida, se pesaron 50 g de miel, los cuales fueron disueltos en 100 ml de agua destilada con ácido clorhídrico (HCL) a pH 2 (agua ácida). Esta solución fue dispuesta en un matraz aforado de 250 ml y se enrasó con agua ácida a dicho volumen. Posteriormente, se pasó esta solución por una columna de resina de amberlita XAD-2 (250 mm de alto x 20 mm de diámetro) a una velocidad de goteo de 2 ml min-1, previo filtrado de la solución con algodón. De esta forma, los compuestos fenólicos quedaron retenidos en la columna. Luego, se lavó tres veces la columna con 100 ml de agua ácida, desechando el líquido del lavado que quedó en el matraz. Para eluir los compuestos fenólicos adheridos a la columna, esta fue lavada con 200 ml de etanol puro al 99,9%, el cual una vez pasado por la columna, se colectó en un matraz limpio y se traspasó a un frasco de vidrio de 500 ml. Esta solución fue rotovaporada a sequedad (35°C) y el residuo se resuspendió en 4 ml de agua destilada. Finalmente, se pasó el extracto por un filtro de jeringa estéril (0,45 μm de poro) y se congeló a -20°C hasta el momento de su utilización.
2.- Bacterias Patógenas utilizadas.
Las bacterias patógenas contra las que se probó el efecto de los extractos correspondieron a Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, provenientes del stock del Laboratorio de Productos Naturales. Las bacterias fueron activadas un día previo a su utilización en un medio de cultivo Agar soya. Al día siguiente se preparó un inóculo bacteriano en suero fisiológico a una concentración de 106 UFC, de acuerdo a la escala de McFarland.
3.- Determinación de la mínima concentración en la cual el extracto actúa como inhibitorio del crecimiento de bacterias.
La mínima concentración inhibitoria de los extractos de miel se determinó mediante el método de microdilución en caldo. Para esto, se utilizaron placas de ELISA de 96 pocillos (12 columnas numeradas y 8 filas con letras), las cuales fueron divididas en dos partes de manera horizontal, con el fin de probar dos extractos por cada placa (4 filas para un extracto). De esta forma, se utilizaron 3 filas para probar el efecto del extracto y 1 fila como tratamiento control. Así, en cada pocillo de la placa se depositó 150 μl de caldo de soya (Difco ™Trypticase Soy Broth) y luego, en cada pocillo de las tres primeras filas se depositaron 150 μl de un extracto. El contenido de los tres primeros pocillos fue diluido a la mitad tomando 150 μl de éste y traspasándolo a los tres segundos pocillos de las filas. Este proceso fue repetido hasta llegar al pocillo n°12 de la placa, con el fin de obtener diluciones seriadas del extracto. Posteriormente, a cada pocillo de las tres filas se les agregó 50 μl de una solución bacteriana a una
concentración de 1,5×106 UFC. Como tratamiento control, se utilizó la cuarta fila, pero ésta vez, sólo con extracto y caldo de soya para comprobar que el extracto estuviera estéril. El proceso anterior fue repetido con las otras cuatro filas de la placa, pero esta vez con una solución bacteriana distinta. La placa se incubó a 37°C durante 24 horas y luego se observaron los resultados comparando los patrones de turbidez con respecto al tratamiento control.
4.- Mínima Concentración Bactericida (MCB)
La mínima concentración bactericida se llevó a cabo a partir de los resultados obtenidos en la prueba de la mínima concentración inhibitoria. Para esto, se prepararon placas de Petri con Agar soya (Difco ™ Tryptic Soy Agar), sobre las cuales se depositaron alícuotas de 4,5 μl de cada uno de los pocillos de la placa ELISA, siguiendo el patrón de dilución de cada una de éstas placas. Las placas de Petri se colocaron en una estufa de incubación a 37°C y después de 24 horas se observaron los resultados. Donde no ocurrió crecimiento bacteriano se encuentra la MCB.

Grafico_Tebo_2

Figura 2. Gráfico de mm de inhibición del crecimiento de las bacterias

Interpretación:
La miel analizada mostró un control significativamente importante sobre el crecimiento de los patógenos Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Pseudomona aeruginosa.
Staphylococcus aureus es una bacteria gram positiva que provoca enfermedades cutáneas infectando heridas que se producen en el cuerpo.
Streptococcus pyogenes es una bacteria gram positiva y es la causa más frecuente de faringitis bacteriana, además de enfermedades potencialmente mortales que comienzan con infecciones de las vías respiratorias y de la piel.
Pseudomona aeruginosa es una bacteria gram negativo que es común en ambientes intrahospitalarios apareciendo en las infecciones postoperatorias.

 

III. Determinación de Fenoles Totales y Capacidad Antioxidante
Métodos: Folin-Cicalteu y FRAP. Espectrofotómetro
Folin-Cicalteu: Se utilizó el método descrito por Singleton y Rossi (1965), para la obtención del contenido de Fenoles Totales de los extractos metanólicos (EM) y diluciones de mieles (DM) a través del uso del reactivo Folin-Ciocalteu. La absorbancia fue medida usando un espectrofotómetro (Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan) a 765 nm. Los resultados se calcularon utilizando una ecuación de regresión de ácido gálico (20 – 200 μM) y fueron expresados como mg equivalentes de ácido gálico (EAG) por kg de miel (mg EAG/kg miel).
FRAP. La Actividad Antioxidante se determinó por el método FRAP que consiste en analizar la habilidad que tiene el plasma para reducir el hierro férrico. La absorbancia fue medida usando un espectrofotómetro (Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan) a 593 nm. Los resultados fueron expresados como milimoles de Trolox por kg de miel (mmoles Trolox/kg miel).

Se utilizaron los Valores de Referencia en arándano cuya actividad antioxidante la máxima obtenida en la naturaleza.
– Fenoles totales: 5980 mg EAG/kg arándano.
– FRAP: 14,2 mmol Trolox/kg arándano.
Estos valores de referencia fueron obtenidos de una media de variedades de frutos de arándano cultivados en Chile.
IV. Identificación de Organismos Genéticamente Modificados (GMO)
Método: Equipo PCR cualitativo y PCR en tiempo real (qPCR).
Se toma una muestra de 10 ml de miel para extraer el ADN (Ácido desoxirribonucleico) mediante un buffer de lisis o rompimiento de paredes celulares. Luego, a través de centrifugaciones sucesivas se obtiene un extracto con ADN purificado sin restos orgánicos celulares. El Extracto obtenido se hace pasar por una micro columna para limpiar el extracto de proteínas y azucares que pueden interferir con los resultados.
A partir del ADN extraído de las muestras de miel, se toma una alícuota, la que se agrega a un preparado especial que contiene los partidores y la enzima polimerasa, componentes necesarios para la amplificación. Además, se realiza un negativo de 35s como control. Luego, las muestras se depositan en pocillos en el equipo de medición (qPCR). En ésta etapa se termocicla durante 40 ciclos a diferentes tiempos y temperaturas. El proceso toma aproximadamente 2,5 horas, al término de las cuales se obtienen las curvas de amplificación, las cuales indican la concentración del gen 35s que, al interpolarla en una curva de calibración, nos permite conocer la concentración final del gen transgénico en la muestra original de miel. La eficiencia de los partidores utilizados en este ensayo fue de un 82%. Se reporta el porcentaje de transgénico presente en la muestra.
En la muestra de miel FIC6MPI016 no se detectó presencia de polen transgénico.

Grafico_Tebo_3

 

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